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大腸桿菌的培養和分離生物教案
作為一名教學工作者，很有必要精心設計一份教案，教案是教學活動的總的組織綱領和行動方案。那要怎么寫好教案呢？以下是小編為大家整理的大腸桿菌的培養和分離生物教案，希望對大家有所幫助。
大腸桿菌的培養和分離生物教案1
——基礎知識和操作過程梳理
一、大腸桿菌
細菌是單細胞的原核生物。細菌細胞的結構有細胞壁、細胞膜、細胞質等。細菌無成型的細胞核，細胞壁由肽聚糖組成。由于細菌細胞壁結構不同，細菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，無莢膜，多產生外毒素；革蘭氏陰性菌細胞壁薄，有莢膜，多產生內毒素。革蘭氏陽性菌對青霉素更為敏感。
大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對人無害，但任何大腸桿菌進入人的泌尿系統，都會對人體產生危害。大腸桿菌在基因工程技術中被廣泛的應用，它的質粒是最常用的運載體，它也是基因工程中常用的受體細胞。
二、培養基配置
微生物生命活動過程中需要的化合物有碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生長因子是微生物生長不可缺少的微量有機物，但不一定需要外界補充，有的微生物可以自身合成。在提供上述幾種主要營養物質的基礎上，培養基還需要滿足微生物生長對ph、特殊營養物質以及氧氣的要求。
我們一般用lb液體培養基來擴大培養大腸桿菌，培養后可在lb固體培養基上劃線分離。以下為本實驗中培養基配置步驟：
1．稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置lb固體培養基時還需加1g瓊脂。
2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50ml。配置lb固體培養基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。
3．調ph：用1mol/l naoh溶液調節ph至偏堿性。
4．滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml lb液體培養基和50ml lb固體培養基，加上棉塞。將培養皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內，1kg壓力滅菌15min。
5．倒平板：滅菌后，待固體培養基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：
�、賹邕^菌的培養皿放在火焰旁，右手拿裝有培養基的三角瓶，左手拔出棉塞；
�、谟沂帜萌瞧�，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；
�、塾米笫謱⑴囵B皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋；
�、艽桨謇鋮s凝固后，將平板倒過來放置。
倒過來放置的目的是防止培養基冷卻過程中形成的水滴落到培養基表面。向培養皿中轉移已滅菌的培養基時，也不要把培養基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養基上繁殖，并污染皿內培養基。
三、滅菌和消毒
1．無菌技術：
�、賹嶒灢僮骺臻g、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；
�、趯⑴囵B器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；
�、蹫楸苊庵車⑸镂廴�，實驗操作應在酒精燈火焰旁進行；
�、鼙苊庖褱缇幚淼牟牧嫌镁吲c周圍的物品相接觸。
2．消毒方法：
�、偃粘Ｉ罱洺Ｓ玫降氖侵蠓邢痉�；
�、趯σ恍┎荒透邷氐囊后w，則使用巴氏消毒法；
�、蹖臃N室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒；
�、軐嶒灢僮髡叩碾p手使用酒精進行消毒。
3．滅菌方法：
�、俳臃N環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；
�、谂囵B基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；
�、郾砻鏈缇涂諝鉁缇仁褂米贤饩�滅菌法，所用器械是紫外燈。
4．比較消毒和滅菌：
比較項
理化因素的作用強度
消滅微生物的數量
芽孢和孢子能否被消滅
消毒
較為溫和
部分生活狀態的微生物
不能
滅菌
強烈
全部微生物
能
5．注意事項：
�、賹嶒炛杏玫拿藁ú荒苡妹撝�，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時的水分；
�、谖锲费b入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內冷空氣，其目的是有利于鍋內溫度升高，隨后關閉排氣閥繼續加熱，加熱結束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務必降至零時打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；
�、墼谟萌魏纹髅筠D接時，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺面上，接種時要在酒精燈火焰旁操作；
�、芘囵B基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養皿壁上，否則容易污染；
�、萁臃N時要膽大心細，動作快捷，這是減少污染的關鍵；
�、藿臃N后，培養皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養基表面，水流擴散會使菌落擴散，就很難形成單菌落了。
四、細菌的分離
1．劃線分離法：用接種環蘸菌液后在含有固體培養基的培養皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養10～20h后，可由一個細菌產生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產生的后代。
其操作步驟是：將培養皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的`一邊，作第1次平行劃線3～5條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養。
取菌種前灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。
2．涂布分離法：先將培養的菌液稀釋，通常稀釋到10－5～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養皿的固體培養基上，用玻璃刮刀涂布在培養基平面上進行培養，在適當的稀釋度下，可產生相互分開的菌落。通常每個培養皿有20個以內的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養后，再做功能性實驗。
劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些。細菌的兩種分離法各有優點,都可采用。
五、菌落和菌種種類的辨認
單個細菌用肉眼是看不見的，但是，當單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，便會形成一個肉眼可見的、具有一定形態結構的子細胞群體，叫做菌落。不同種類的細菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。
細菌的菌落表面一般是光滑而濕潤的，有黏稠性，多數透明或半透明，但也有細菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細的菌絲并可產生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環挑動；酵母菌落類似于細菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數呈紅色。如果菌落無法辨認，只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下細菌一般為桿狀、球狀和弧狀，直徑都在1um左右；放線菌菌絲是沒有橫隔的分枝絲狀體，氣生菌絲頂端分裂成串狀孢子，孢子絲有直線形、螺旋狀、彎曲式或輪生等；酵母有卵圓型或絲狀，但卵圓形細胞大于細菌，直徑約5~7um。
大腸桿菌的培養和分離生物教案2
一、大腸桿菌
1．大腸桿菌屬于革蘭氏________性菌，為________型的腸道桿菌。
2．結構：屬于________生物。
3．用途：是在________技術中被廣泛采用的工具。
4．與人類的關系：它生活在人類的________中，一般對人________(“有”還是“無”)害。有一些菌株對人體能產生危害，因為它們可以侵蝕________并產生________。任何大腸桿菌如果進入人的________系統，都會對人體產生危害。
答案：
1.陰 兼性厭氧
2．原核
3．基因工程
4．腸道 無 腸黏膜 毒素 泌尿
二、細菌的培養和分離
1．細菌的培養：
(1)細菌的繁殖：細菌以________的方式繁殖，分裂速度很快，約________分裂一次。
(2)培養細菌的方法：培養細菌，需要將________________________________________________________________________
轉移到________中，一般用________來轉移帶菌的培養物。
(3)用不同培養基培養細菌的差別：
接種后，培養細菌的培養基類型 接種方法 接種后培養的時間(單位：小時) 培養結果
液體培養基 接種環直接接種 培養8 h后 每毫升培養基中有________個細菌
固體培養基 用接種環在培養基上用________________________________________________________________________的方式接種(該法還可以用于______) 培養10～20 h后 一個細菌細胞會繁殖成許多個細菌細胞，這些細胞________________________________________________________________________________，形成____________________________________________________________
2.細菌的分離：
(1)分離的方法與特點：分離細菌有________和________2種。前者方法簡單，后者操作復雜，但是______________________________________________________________更易分開。
(2)本實驗進行大腸桿菌分離，是用________法，就是在________培養基上進行細菌的________。
答案：1.
(1)分裂 20 min
(2)已有細菌的培養物 新的培養基 接種環
(3)幾億 劃線 分離細菌 緊緊聚集在一起菌落
2.(1)劃線分離法 涂布分離法 單菌落
(2)劃線分離固體平面劃線培養
三、滅菌操作
1．滅菌操作的原因：為了獲得________的培養物，其關鍵是防止外來________的入侵污染。因此，在培養微生物時必須進行________操作。
2．無菌操作的條件：
(1)首要條件是________必須是無菌的；
(2)________必須是無菌的；
(3)________的過程必須是無菌的等。
答案：1.純凈 雜菌 無菌
2．(1)各種器皿 (2)各種培養基 (3)菌轉移操作
四、大腸桿菌的培養和分離實驗
1．實驗目的：
(1)進行大腸桿菌的________，利用________培養基進行細菌培養的操作；
(2)進行大腸桿菌的________，用________培養基進行細菌的________培養；
(3)說明大腸桿菌培養的條件和操作要求的原理。
2．實驗步驟
(1)滅菌：用________在________壓力下對LB液體培養基、LB固體培養基和培養皿進行滅菌________min。
(2)自________向________中轉移并分裝固體培養基：
待冷卻至______左右，將三角錐形瓶中的______培養基，在______上分裝至幾個______中，制成______培養基。
(3)將大腸桿菌自________轉移到________中的________培養基中培養：
將大腸桿菌用________在無菌操作下接種至三角錐形瓶中的________培養基中，在________搖床振蕩培養________，完成大腸桿菌的培養。
(4)將菌液在________培養基上進行________分離：
從前一步培養得到的菌液中獲取菌種，用________以__________法接種至第二步所制得的__________培養基中，在________℃恒溫箱中培養________h后觀察菌落。
(5)菌種保存：
在無菌操作下將________用________取出，再用________法接種在________上，________培養________后，________冰箱保存。
3．分離實驗的結果及相應結論：
觀察中若看到在________的末端出現________，則表明菌已被分離了。
4．大腸桿菌分離的用途：________的'通用方法，也是用于________的最簡便方法之一。
答案：1.(1)擴增 液體 (2)分離 固體平面 劃線
2．(1)高壓鍋 1 kg 15 (2)三角瓶 培養皿 60 ℃
固體 超凈臺 培養皿 固體平面 (3)斜面 三角瓶 液體
接種環 液體 37 ℃ 12 h (4)固體平面 劃線 接種環
劃線 固體平面 37 12～24 (5)單菌落 接種環 劃線 斜面 37 ℃ 24 h 4 ℃
3．劃線 不連續的單個菌落
4．消除污染雜菌 篩選高表達量菌株
核心解讀
1．微生物、細菌與大腸桿菌之間有怎樣的關系？
(1)概念內涵：其關系圖解見下
(2)結構上：三者都是結構簡單，形體微小的生物，但是從細胞角度看其結構是不同的，具體如下：
2．培養大腸桿菌的LB培養基中有各種物質，為什么選擇這些物質，這些物質有什么作用呢？
(1)人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出了供其生長繁殖的營養基質——培養基。雖然各種培養基的具體配方不同，但一般都含有五大營養要素，即水、無機鹽、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生長因子(不同的細菌需要的各不相同，有物種差異，它主要補充自身不能合成的或合成能力較弱的，但卻是生長繁殖必需的物質)。見下表：
微生物的營養要素 定義 功能 類型 化合物類型 常用物質
碳源 凡可構成微生物細胞和代謝產物中碳架來源的營養物質稱為碳源 構成細胞物質，供給微生物生長發育所需要的能量 無機碳(自養型微生物用) 無機物 CO2、NaHCO3、CaCO3等
有機碳(異養型微生物用) 蛋白質、核酸類 牛肉膏、蛋白胨、花生粉餅、明膠、氨基酸等
糖類脂質等 葡萄糖、蔗糖、淀粉等
氮源 凡是構成微生物的細胞物質或代謝產物中氮素來源的營養物質稱為氮源 主要是提供合成原生質和細胞其他結構的原料，一般不作能源 無機氮 銨鹽 NH3、(NH4)2SO4
硝酸鹽 KNO3
N2 空氣
有機氮 牛肉膏、蛋白胨、醇母膏、尿素、明膠等
生長因子 一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳、氮源自行合成的所需極微量的有機物 一般是酶和核酸的組成成分 酵母膏、玉米漿、黃豆餅粉、動植物組織液、麥芽汁等，復合維生素
水 作用：組成成分；反應介質；物質運輸媒體；熱的良導體
無機鹽 作用：維持滲透壓、pH等
(2)大腸桿菌的LB培養基
微生物的營養要素 本實驗中大腸桿菌LB培養基配方 培養基配方與微生物營養要素的對應關系
LB液體培養基 LB固體培養基
氮源、
碳源、
無機鹽、
生長因子、
水
瓊脂1 g
蛋白胨0.5 g 主要提供大腸桿菌的氮源、碳源需求
酵母提取物0.25 g 主要提供生長因子
NaCl 0.5 g 提供無機鹽
水 50 mL 提供水
(3)此外配方中還要注意pH等。
3．該實驗中這些操作的原因
(1)三角錐形瓶中的LB固體培養基滅菌后，需要冷卻到60 ℃左右時，才用來轉移和分裝，制成固體平面培養基，為什么？你用什么簡易方法快速估計該溫度？
因為三角錐形瓶中的LB固體培養基中有瓊脂，它在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，當冷卻到60 ℃左右時，不會因溫度過高燙手而不易操作；也不會因為溫度過低而使三角錐形瓶中的培養基凝固，最終無法轉移分裝制成新的平面培養基。
簡易估計溫度的方法：可以用手觸摸滅菌后的三角錐形瓶，感覺錐形瓶由燙手轉為剛剛不燙手時，則說明已經冷卻到60 ℃左右了。
(2)進行恒溫培養時，為什么要將培養皿倒置？
恒溫培養時，培養基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發，倒放培養皿則會使水蒸氣凝結成水滴留在蓋子上；如果正放培養皿，則水分形成的水滴會落入培養基表面并且擴散開。如果培養皿中已形成菌落，則菌落中的菌會隨水擴散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的，培養皿中的菌落還有可能被蓋子上掉落的水給污染。
(3)將大腸桿菌用接種環自斜面轉移到液體培養基中培養時，為什么接種環必須先深入到斜面冷卻后，才能再取斜面上的菌體？
接種環在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，一直灼燒至紅，溫度很高，若不冷卻就直接用其取斜面上的菌體，菌體可能因為接觸高溫接種環而死亡，導致大腸桿菌的轉移培養失敗。
(4)用劃線法分離大腸桿菌中，第一次和隨后的幾次劃線前都要灼燒接種環，它們的原因一樣嗎？在劃線結束后仍然要灼燒接種環這又是為什么呢？
雖然每次灼燒都是為了滅菌，但所滅的菌種和原因卻不一樣。
灼燒接種環的時間 消滅的菌體 原因
第一次劃線前 其他雜菌 防止其他雜菌的侵入而造成污染
隨后的幾次劃線前 上次劃線結束后殘留在接種環上的實驗菌(本實驗為：大腸桿菌) 為了使下一次劃線時，接種環上的菌來自上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，最終獲得單個菌落，實現菌的分離
最后一次劃線結束后 為了防止實驗菌殘留于接種環而污染環境和感染實驗人員
(5)用劃線法分離大腸桿菌時，每次的劃線是怎么樣的？對隨后的劃線的起點有什么要求？為什么這樣要求呢？
每一次的劃線 依次的2次劃線之間的關系 各次劃線的分布
圖形輔助理解
劃線的要求 不能出現線條的重疊 第二次以及隨后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開始 不要將最后一區的劃線與第一區相連
這樣要求的原因 使線條末端細菌的數目比線條起始處要少 因為劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終得到有單個細菌繁殖而來的單菌落 若相連，則可能最后一次劃線末端處的細菌與第一次的疊加，細菌的數目不是最少的，不能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終將很難獲得單菌落
4．消毒與滅菌一樣嗎？
概念 常用方法 應用的范圍
消毒 使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min 一般物品
巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 對于一些不耐高溫的液體，如牛奶
化學藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等
滅菌 使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌
干熱滅菌：160～170 ℃下滅菌1～2 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌
高壓蒸汽滅菌：121 ℃條件下，滅菌15～30 min 培養基及容器的滅菌
5.本實驗中還需要了解哪些基礎知識才更便于掌握和理解呢？
(1)牛肉膏蛋白胨的知識
牛肉膏和蛋白胨來源于動物原料，含有糖、維生素和有機氮等營養物質。
1 000 mL牛肉膏蛋白胨培養基的營養構成
培養基組分 提供的主要營養
牛肉膏 5 g 碳源、磷酸鹽和維生素
蛋白胨 10 g 氮源和維生素
NaCl 5 g 無機鹽
H2O 定容至1 000 mL 氫元素、氧元素
(2)巴氏消毒法的知識
巴氏消毒法也稱做低溫消毒法。
日常生活中經常用到煮沸消毒法。在100 ℃煮沸 5～6 min 可以殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢。對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養成分不被破壞。
題例領悟TILILINGWU
【例題1】 下列操作屬于滅菌的是( )
A．用酒精擦拭實驗人員的雙手
B．用氯氣處理水源
C．將接種環在酒精燈火焰上灼燒至紅
D．殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物
解析：此題考查對微生物實驗中滅菌的理解。對微生物培養來說，滅菌操作十分重要，其目的就是為了獲得純凈的培養物，其關鍵是防止外來一切雜菌的入侵，不僅僅是對人體有害的微生物。滅菌操作一般使用強烈的物化因素(如：灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌等)。而不是使用較為溫和的物化方法。
答案：C
消毒與滅菌是不同的。兩者除了在物化手段上是否強烈外，所消滅的微生物內容也是不同的。滅菌是消除一切雜菌，而消毒僅僅殺死對人體有害的微生物。消毒往往無法消滅微生物的芽孢和孢子。
【例題2】 下列關于平板劃線的操作及敘述，正確的是 …
( )
A．灼燒接種環之后，為避免其他雜菌的干擾，應立即伸入菌液取菌種
B．劃線結束后，為避免實驗菌污染環境和感染操作者，所以必須再次灼燒接種環
C．在第一次劃線前灼燒接種環和每次劃線前灼燒接種環的目的相同
D．劃線時最后一區域一定要與第一區域相連，達到首尾相接
解析：此題考查對劃線法分離大腸桿菌的掌握。這是本實驗的一大重點和難點。A的操作是錯誤的，灼燒接種環之后，要冷卻后方能取菌種，以免溫度太高殺死菌種。B的操作完全正確。C的敘述是錯誤的，它們的灼燒目的完全不同，第一次劃線前的灼燒是為了殺死其他雜菌，保證實驗菌的純凈，而隨后的灼燒卻是為了殺死殘留于接種環上的實驗菌，保證實驗菌隨劃線次數的增加而減少，每次劃線的菌種來自上一次劃線的末端。D的操作也是不正確的，不應該相連，這樣才能使最后一次劃線不受第一次劃線的干擾。
答案：B
大腸桿菌的分離所采用的就是劃線分離法。這一方法十分重要。我們不僅要知其每一步具體的操作，還要知其所以然，還要關注注意事項，避免踏入誤區。
隨堂訓練SUITANGXUNLIAN
1細菌培養過程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌( )
A．接種針、手、培養基 B．高壓鍋、手、接種針
C．培養基、手、接種針 D．接種針、手、高壓鍋
答案：C 解析：滅菌是微生物培養過程中的重要環節。其中高壓蒸汽是為了殺滅培養基中的雜菌；酒精擦拭雙手，是滅手上的雜菌；而接種針在火焰上灼燒，就是為了滅接種針上的菌。故C選項是正確的。
2下列關于倒平板的操作姿勢的敘述中，正確的是( )
A．右手無名指及小指夾持含有固體培養基的三角瓶封口膜
B．右手大拇指、食指拿著三角瓶
C．左手拿著培養皿，蓋子放于桌子上
D．倒平板時，為防止溫度過高，暫時熄滅酒精燈
答案：A 解析：倒平板技術是微生物技術中的基本技術。只有A是正確的。B中手指姿勢錯誤。C錯在培養皿蓋放在桌上了。D中熄滅酒精燈不對，整個過程都需在酒精燈火焰旁完成。
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